研究主要集中在前列腺素（PGE2）合成酶mPGES-1和mPGES-2的功能特点以及肾脏疾病的治疗药物方面，其中包括：（1）研究成果阐明了mPGES-1与糖尿病肾病之间的关系；（2）首次发现了mPGES-2在体内的功能作用，下调mPGES-2会促进肝脏中的GLUT2的表达，在肝脏细胞葡萄糖代谢中起重要作用，论文发表在Journal of hepatology期刊上，影响因子11.336；（3）研究发现线粒体复合物I型抑制剂可以通过减少炎症反应和氧化应激来改善阻塞性肾病。（4）另外还有研究发现谷氨酰胺酶1（GLS1）的抑制剂可以有效的改善多囊肾病的发生发展。至今以第一作者发表SCI收录论文8篇。该导师现在是江苏省双创博士人才和江苏省特聘教授，并曾作为“Plos One”和“Mediators of Inflammation”的审稿人。现任中国药理学会肾脏药理分会委员，中国药理学会生化与分子药理学专业委员会青年委员，中国生理学会肾脏生理专业委员会青年委员。

范晨宇，男，临床医学系临床专业2017级本科生，曾获校级三等奖学金，优秀班干部等。现作为成员参与“挑战杯”竞赛的“基于抑制mPGES-2活性的芒果苷在急慢性肝脏疾病中的作用及机制探究”项目。拥有扎实的基础医学及生物学知识和浓厚的科研兴趣，自2018年上半年开始进入新药研究与临床药学重点实验室，一直跟随老师学习，能熟练使用实验室常见的精密仪器，能够熟练地运用中国知网、Pubmed等数据库查阅资料，娴熟操作文献管理软件EndnoteX9，科研作图软件Graphpad prism以及Photoshop等，具有一定的英文论文写作基础，基于以上科研经历在此与其他成员创新性地探究ADPKD的发病机制。

薛钧文，男，临床医学系临床医学专业2017级本科生，现担任临床医学系17本临床5班文体委员，有较强的组织、领导及团队协作能力。曾获得校一等奖学金、社会奖学金、校优秀学生干部、优秀团员、团的活动积极分子等荣誉称号，有很强的自主学习能力，亦有扎实充分的医学、理科知识基础以及熟练的实验操作技能，对科研怀有浓厚的兴趣，曾经主导组员设计一项生理学机能实验，熟悉各种基本的实验器材及操作，并有优异的阅读能力和英语水平，擅长阅读检索文献材料。

倪想，男，临床医学系临床医学2017级本科生，工作认真负责，有较强的自主学习能力，曾获校级二等奖学金、三好学生，对科研和本课题有很大的兴趣，对科学问题刻苦钻研，刨根问底，能熟练使用中国知网和迈特思创等检索平台，掌握一定的实验技能，同时具有较好的信息处理能力。

刘煜清，女，药学院临床药学专业2018级本科生，现担任药学院学生会体育部干事，工作认真，学习态度端正，心思细腻，热爱科研，严谨负责，能较熟悉的操作实验仪器，擅长信息收集整理，能较熟练用软件管理文献。

两位主持人长期合作，各有所长，配合默契，另外两名项目成员也都经历过科研培训，具有一定的实验技能与组织能力。团队成员来自不同的年级和院系，也扩大了整体的知识面以及增加了团队实验的时间。项目指导老师具有此领域扎实的专业知识和丰富的实验研究基础，给团队提供了较好的平台。以申请者现有的研究基础以及对项目实践的热情，推动了本次创新训练计划的申报。

1、项目研究背景（国内外的研究现状及研究意义、项目已有的基础，与本项目有关的研究积累和已取得的成绩，已具备的条件，尚缺少的条件及方法等）

常染色体显性遗传型多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是人类常见的单基因遗传疾病之一，主要发病于成年且预后不良。发病率约为1/1000～1/400，主要是由Pkd1（polycystic kidney disease 1）或Pkd2（polycystic kidney disease 2）基因突变所致^[1]。Pkd1和Pkd2基因分别编码多囊蛋白PC1（polycystin-1）和PC2（polycystin-2）^{[2, 3]}， 其中Pkd1发生突变所导致的多囊肾病较严重，且发病时间早于Pkd2突变。该病以双侧肾脏多发性进行性生长的囊泡为主要特征，增大的囊泡将不断地挤压周围正常的肾脏组织，导致肾脏结构的改变和肾功能的丧失，最终导致终末期肾病（End-stage renal disease, ESRD）^{[4, 5]}。据统计，在全球有4%～10% 的ESRD患者是由ADPKD所导致的。 ADPKD终末期患者主要依赖于终身血液透析或肾移植来维持生命^[6]。目前尚无有效的临床药物来延缓多囊肾病的发展，所以寻找新的有效治疗药物至关重要。

   图1. ADPKD的发病机制和治疗策略。

            ADPKD的发病机制复杂，尚不完全清楚。许多研究表明，ADPKD发展过程中，是通过多种细胞内信号途径调控细胞异常增殖和囊液分泌，包括MAPK/ ERK通路^{[7, 8]}、PI3K/AKT通路^[9]、mTOR通路^[10]、和Wnt/β-catenin通路^[11]。 最近，多项研究发现，许多天然化合物通过这些途径来抑制囊泡并减轻ADPKD的进展^[12-14]。

       （1）PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后相比于野生鼠肾损伤更严重并伴随微囊泡的形成

   图2. 缺血再灌注前后PKD1杂合小鼠与野生小鼠的BUN对比以及两组鼠的生存曲线

        （2）生物信息学分析显示PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后迅速死亡与体内增强的细胞凋亡通路有关
    我们将PKD1杂合小鼠和野生小鼠进行肾脏动脉夹闭45分钟，之后恢复肾脏血供，24h后处死小鼠，取PKD1杂合小鼠和野生小鼠的肾脏组织做蛋白组学分析（图3），从免疫炎症角度，筛选出相关蛋白并将所得到的变化显著的蛋白以及其所在的潜在生物途径（Biological process）用Cytoscape软件进行数据处理，最终筛选出了包含有6个变化显著的蛋白的细胞凋亡途径【GO:0006915】，因此我们猜测PKD1小鼠在缺血再灌注后迅速死亡与该途径的增强有关。并且这6个蛋白中，Prkcd（Protein kinase C delta type蛋白激酶C delta型）和Cycs（cytochrome c 细胞色素C）与细胞凋亡通路密切相关，因此我们认为Prckd以及细胞色素C在小鼠肾脏缺血再灌注前后发挥重要的作用，研究其发挥作用的内在机制将有助于研究出PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后死亡率高于野生小鼠的原因。

   图3 生物信息学分析的热图分析结果

【参考文献】

[1] Ghata, J. and Cowley, B.D., Jr. Polycystic Kidney Disease. Compr Physiol, 2017, 7(3);945-975.
[2] Harris, P.C. and Torres, V.E. Polycystic kidney disease. Annu Rev Med, 2009, 60;321-37.
[3] Leuenroth, S.J. and Crews, C.M. Targeting cyst initiation in ADPKD. J Am Soc Nephrol, 2009, 20(1);1-3.
[4] Zhou, J. Polycystins and primary cilia: primers for cell cycle progression. Annu Rev Physiol, 2009, 71;83-113.
[5] Cornec-Le Gall, E.,et al. Type of PKD1 mutation influences renal outcome in ADPKD. J Am Soc Nephrol, 2013, 24(6);1006-13.
[6] Khan, S.,et al. Peritoneal Dialysis for Patients with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Perit Dial Int, 2017, 37(4);384-388.
[7] Xu, T.,et al. Celecoxib inhibits growth of human autosomal dominant polycystic kidney cyst-lining epithelial cells through the VEGF/Raf/MAPK/ERK signaling pathway. Mol Biol Rep, 2012, 39(7);7743-53.
[8] Calvet, J.P. Strategies to inhibit cyst formation in ADPKD. Clin J Am Soc Nephrol, 2008, 3(4);1205-11.
[9] Santoso, N.G., Cebotaru, L., and Guggino, W.B. Polycystin-1, 2, and STIM1 interact with IP(3)R to modulate ER Ca release through the PI3K/AKT pathway. Cell Physiol Biochem, 2011, 27(6);715-26.
[10] Stephanis, L.,et al. Double inhibition of cAMP and mTOR signalling may potentiate the reduction of cell growth in ADPKD cells. Clin Exp Nephrol, 2017, 21(2);203-211
[11] Happe, H.,et al. Toxic tubular injury in kidneys from Pkd1-deletion mice accelerates cystogenesis accompanied by dysregulated planar cell polarity and canonical Wnt signaling pathways. Hum Mol Genet, 2009, 18(14);2532-42.
[12] Park, E.Y., Woo, Y.M., and Park, J.H. Polycystic kidney disease and therapeutic approaches. BMB Rep, 2011, 44(6);359-68.
[13] Sun, Y., Zhou, H., and Yang, B.X. Drug discovery for polycystic kidney disease. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(6);805-16.
[14] Blair, H.A. and Keating, G.M. Tolvaptan: A Review in Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Drugs, 2015, 75(15);1797-806.
[15] BASTOS A P, PIONTEK K, SILVA A M, et al. Pkd1 Haploinsufficiency Increases Renal Damage and Induces Microcyst Formation following Ischemia/Reperfusion [J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2009, 20(11): 2389-402.

2、项目研究目标及主要内容
【研究目标】
   明确细胞凋亡通路对PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后肾病变加重和死亡率增加的影响。阐明细胞凋亡通路对于ADPKD发生发展的影响，尝试阐明其中的发生机制。
【研究内容】
   一、Ksp-Cre;Pkd1^fl/+ 小鼠模型的建立
            Ksp-Cre;Pkd1^fl/fl小鼠是利用Cre-loxp系统建立的肾脏特异性敲除Pkd1的小鼠模型，由Ksp-Cre小鼠以及Pkd1^fl/fl小鼠繁殖可得到Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠，之后可使Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠之间配繁得到所需数量的Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠。值得注意的是，Ksp-Cre;Pkd1^fl/fl小鼠在出生后2周内发生肾衰竭，3周左右死亡，而同窝的Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠则表型正常。将所得到的小鼠取鼠尾运用PCR法作基因鉴定，如图 4 所示，例如Ksp-Cre;Pkd1^fl/+鼠的鉴定，其中Cre呈现阳性且Flox电泳条带在300和400bp两处呈现阳性的小鼠即为目的敲除小鼠。

图4. Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠的来源及鉴定。（A）肾脏特异性敲除Pkd1基因的小鼠来源。（B）采用 PCR 方法鉴定小鼠的基因型。
   二、明确细胞凋亡通路对于PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后肾病变加重和死亡率增加的影响
   （1）对于细胞凋亡通路进行主要分子过表达
   对于PKD1杂合小鼠和野生小鼠进行细胞凋亡通路中主要研究分子（Prkcd以及细胞色素C）过表达，增强此通路效应，再对于这两组小鼠进行IR实验，24h后处死小鼠，取血测SCr（serum creatinine）以及BUN(Blood urea nitrogen)；取肾脏组织做H&E染色、免疫组化分析以及电镜照片分析囊泡的形成情况；提取肾脏RNA作RT-PCR分析；提取肾脏组织蛋白作Western Blot 分析PC1、Prkcd以及细胞色素C的表达水平。
   （2）对于细胞凋亡通路进行主要分子低表达
   对于PKD1杂合小鼠和野生小鼠敲低细胞凋亡通路中主要研究分子（Prkcd以及Cycs）以降低此通路效应，再对于这两组小鼠进行IR实验，24h后处死小鼠，取血清测SCr以及BUN；取肾脏组织做H&E染色、免疫组化分析以及电镜照片分析囊泡的形成情况；提取肾脏RNA作RT-PCR分析；提取肾脏组织蛋白作Western Blot 检测PC1、Prkcd以及细胞色素C的表达水平。
【数据分析】
   应用SPSS18.0统计软件对结果进行统计， P<0.05为差异有统计学意义。
3、项目创新特色概述
   本课题主要研究细胞凋亡通路对ADPKD发生发展的影响，阐明肾缺血再灌注后PKD1杂合小鼠死亡率高于野生小鼠的内在机制。本课题将对ADPKD的发生发展提出新的认识，很可能为ADPKD相关疾病的研究和治疗提供一个新的切入点。
4、项目研究技术路线

5、研究进度安排
   本项目拟在两年内（2019.05～2021.05）完成，具体安排如下：
第一阶段：2019年5月至2019年11月
1)建立Ksp-Cre;Pkd1^fl/+小鼠模型，喂养3个月以上。
2)使用病毒载体对实验组小鼠体内Prckd以及细胞色素C分子进行过表达或敲低。
第二阶段：2019年12月至2020年10月
1)对于实验组和对照组进行肾脏缺血再灌注后处死小鼠，取小鼠外周血以及肾脏组织。
2)检测实验小鼠以及对照小鼠外周血BUN以及Creatinine含量，做肾脏切片进行H&E染色，做电镜照片，进行免疫荧光染色。
3)根据以上实验结果，进一步完善实验设计。
第三阶段：2020年11月至2021年5月
1)在分子水平进行RT-PCR实验，进行Western Blot 实验检测PC1、Prkcd以及Cycs的表达水平。
2)整理资料、总结，撰写论文，上报科研成果。

6、项目组成员分工

1.实验平台

项目组的实验基地是徐州医科大学新药与临床应用重点实验室，该实验室建有净化动物室、生化检测室、分子生物学室、细胞培养室、精密仪器室及大型仪器室等多个功能实验室，具备进行药理学实验、生化指标测定与分子生物学实验等仪器设备及条件。目前已建立实验室开放制度，可以为项目的开展提供所需的实验场所。

2.配套经费、相关扶持政策

学校支持并鼓励大学生参与科研实践活动。本项目团队所属的临床医学系，注重学生实践能力和科研素质的培养，严谨、负责的导师对训练项目进行实时指导，为项目的顺利实施提供条件保障。

研究目标：本项目在立项时的研究目标旨在明确细胞凋亡通路对PKD1杂合小鼠在缺血再灌注后肾病变加重和死亡率增加的影响、阐明细胞凋亡通路对于常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)发生发展的影响，尝试阐明其中的发生机制，经过一年多的潜心研究，我们从小鼠饲养，到建立小鼠的缺血再灌注模型，到取材，以及之后的蛋白质谱分析和生物信息学分析，明确了在ADPKD参与细胞凋亡通路的具体分子，如Grb2 和 Map2k1等分子在常染色体显性多囊肾病发生发展过程中潜在的促进作用，为该疾病的治疗提供了可能的药物作用靶点。

研究过程：项目进度超前完成，所有任务安排都在有计划地顺利推进，并取得了一系列成果。从建立了PKD1杂合子小鼠模型，到成功建立了PKD1杂合子小肾脏缺血再灌注模型，到取得肾脏组织标本后的染色处理，以及小鼠的血清学检测，并行采用高通量蛋白质谱分析技术，采用生物信息学的分析方法，获得了富集的生物学过程和潜在的药物靶点。与此同时，我们并行开展的课题研究表明，ICG-001在体外囊泡模型中能够抑制囊泡的发生和发展，但ICG-001会抑制胚胎肾的发育并且无法治疗PKD小鼠的肾囊肿，因而无法作为治疗ADPKD的药物。从小鼠饲养，到建立小鼠的缺血再灌注模型，到取材，以及之后的蛋白质谱分析和生物信息学分析，撰写论文，投稿，本团队在计划实施的过程中虽然会遇到大大小小的难题，但都及时解决，确保进度有条不紊地推进。

不仅仅在科研创新方面，本项目组的成员还活跃在学科竞赛的领域，释放着青春的光和热。本项目的第一负责人范晨宇所在的团队参加了2019年“挑战杯”项目，从校赛，到省赛，到国赛，整个备战团队披荆斩棘，最终取得了省赛“特等奖”，国赛“二等奖”的成绩，在全国的舞台上展现了徐医人的风采。

本项目预计发表1篇SCI论文，竞赛获奖1次，至申请结题时，已经有一篇SCI投稿在Journal of proteomics（IF=3.537，在审，第一作者：范晨宇），一篇中文论文投稿在北大核心期刊《中国临床药理学杂志》（已见刊，第一作者：范晨宇），获得学科竞赛两次（挑战杯江苏省选拔赛“特等奖”，挑战杯全国赛“二等奖”，获奖人：范晨宇），在指导教师孙莹教授的带领下，本项目组成员齐心协力，提前并超额完成了任务。

1、本项目首次对肾脏缺血再灌注后的PKD1杂合小鼠和野生小鼠的肾脏组织进行高通量蛋白质组学分析，获得了蛋白质谱分析高通量结果。

2、本项目首次对肾脏缺血再灌注后的PKD1杂合小鼠相比于野生小鼠病情恶化的可能机制进行探讨和研究，并提出了潜在的生物学过程和涉及到的分子通路。

3、本项目首次提出了Grb2 和 Map2k1等分子在常染色体显性多囊肾病发生发展过程中潜在的促进作用，为该疾病的治疗提供了可能的药物作用靶点。

时光荏苒，岁月如歌，回首过去的的科研历程，这期间充满了酸甜苦辣，更有收获和成长。

通过参加大学生创新训练计划，团队成员对科研的理解更加深刻，掌握了一定的科研课题设计，实验操作和分析问题，解决问题的能力，对于科研的模块化思维：疾病，表型，模型，检测方法，和分子标志物这五恒量的理解更上一层楼。“遇事迎难而上”，不畏难，同时虚心向老师以及高年级的同学求教，是团队在科研历程中培养出来的解决思路，也是团队成员在步入社会和工作岗位前上的重要一课。

衷心感谢指导老师孙莹教授，一直以来对本团队的学习、工作和生活给予的谆谆教诲和悉心指导。感谢孙老师在实验技能的培养、选题、课题设计、论文写作等方面的悉心指导和严格要求。每一个过程都凝结着她的辛劳和智慧，孙老师严谨求实的治学风范、兢兢业业的工作态度、坦诚谦逊的做人风范是本团队成员终身学习的榜样。

范晨宇同学负责的国家级创业项目（关于PKD1杂合子小鼠肾缺血再灌注后疾病恶化的机制研究），自从申报成功后，进度一直有条不紊地推进，在团队的密切合作下，超前完成任务，并取得了可喜的成绩，整个团队在科研能力和创新精神方面都得到了大幅的锻炼和提升，经费使用合理，同意申请结题。

                                                                                                                指导教师签名：孙莹

                                                                                                                2020年 6 月 14 日