入选江苏省“六大人才高峰”高层次人才、江苏省“333高层次人才培养工程”、江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象、盐城师范学院中青年学术带头人和青年拔尖人才培养计划培养对象；江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师和盐城市新世纪“111工程”人才，“江苏高校优秀科技创新团队”成员。

主持国家自然科学基金、国家星火计划项目、江苏省自然科学基金、江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目、江苏省高校自然科学基础研究和盐城市农业科技创新项目等课题。

曾获江苏省科学技术三等奖、江苏省科技进步三等奖、盐城市科学技术三等奖、盐城市自然科学优秀学术论文二等奖等奖励。

以第一作者在PLoS One、BMC Genomics、Gene Expression Patterns、Molecular and Cellular Probes等国内外期刊上发表论文20多篇，其中SCI收录8篇。获得授权国家发明专利2项。

1、自身具备的知识条件

纳豆激酶是在纳豆发酵过程中产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，最早于1987年由日本科学家须见洋行博士发现并命名。此后，人们对纳豆激酶的生产及生化特性、保健功能进行了研究，对纳豆激酶的理化性质、药理作用、检测方法等方面已有了一定的了解，纳豆激酶类的药品及保健食品的研究正在进行之中。

纳豆激酶被发现具有纤溶、降胆固醇、降血脂、降血压、抗菌和抗氧化等多方面作用。纳豆激酶是目前所发现的近200种具有口服纤溶作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白酶。100g湿纳豆中含有的纳豆激酶活性相当于16万单位的尿激酶，可折合人民币价格达1万元，具有很高的经济价值。然而，关于纳豆激酶降血脂的研究较少。

项目组成员来自生物制药专业，较为系统地学习了生物化学、天然药物化学、生理学、药理学等基础课程和专业课程，掌握了必要的药学实验技能。

2、前期工作

在指导老师的安排下，项目组成员开展了高产纳豆菌种的筛选与鉴定工作，获得了高产纳豆的菌种；完成了激酶样品纤溶活性的测定等实验，掌握了多种仪器设备的操作技能，并能熟练地运用统计学软件分析实验数据。

项目组成员对纳豆产品已有较多的了解，在导师的指导下，我们积极参与纳豆健康食品的研究，用以参加学校举办的大学生三创大赛，并于初赛中脱颖而出，正在一起努力为决赛做准备。

3、项目组成员的基本情况

项目组成员都有各自的特长以及兴趣爱好；参与了指导老师的科研项目，能够独立思考，运用专业知识分析问题，具有一定的创新意识和探索精神，具备基本的科研素质与从事科研工作的能力；具有较强的团结协作精神和集体荣誉感；多人获得各类奖学金、校院“优秀学生干部”、“三好学生”等奖励。

项目组成员来自同一个班级，共同参与过化学实验、生物基础实验、药学基础实验等课程，彼此之间有很好的了解和默契度，便于实验操作时的分工以及合作。

1、项目研究背景（国内外的研究现状及研究意义、项目已有的基础，与本项目有关的研究积累和已取得的成绩，已具备的条件，尚缺少的条件及方法等）

1.1 国内外的研究现状及研究意义

随着人们生活水平的不断提高和饮食结构的改变，高血脂症悄然地挤身于富贵文明病行列当中。高血脂症是一种常见而多发的代谢性疾病，可以导致动脉粥样硬化，还会诱发冠心病、心肌梗死和脑卒中等疾病。高血脂症常见于中老年人，但随着饮食结构的改变及饮酒量的上升，青年人其患病率也在逐年增高。据统计，全世界每年有3000万人死于高血脂引起的相关疾病。适量运动、健康饮食以及降脂药物治疗都是预防和治疗高脂血症的主要方法。

已经开发的降血脂药物如他汀类、贝丁酸类、烟酸类、树脂类、抗氧化剂类以及中药类等都是有效的药物，但面临的最大问题是长期服用带来的副作用。因此，除了采用必要的药物治疗，还应结合有效的非药物治疗手段，尤其在高脂血症的预防方面，非药物治疗的作用更为重要。

纳豆是一种传统的发酵大豆食品，特别是近年来，更因其具有多种显著的保健功能而受到世界各国的关注。研究发现，纳豆不仅可以溶解血栓，还具有降血脂、降血压、抗菌、抗氧化、预防癌症等多种生理调节功能。纳豆激酶是从发酵食品纳豆中提取出的一种溶纤酶，其药理作用包括溶血栓和抗血栓作用、调血脂和抗动脉粥样作用、降血压和保护心肌缺血作用等。因此，利用纳豆提取纳豆激酶，以独特的高效性、安全性、稳定性、成本低廉等特点而具有极大的降血脂开发前景。

1.1.1 纳豆激酶的理化性质

纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，溶于水，其干粉呈白色或淡黄色，280nm波长处有吸收峰。根据基因DNA序列推出其氨基酸序列，算出该酶的准确分子量为27728，其等电点为8.6±0.3，是由275个氨基酸构成的单链多肽结构。在pH值6.0-12.0的范围内具有很强的纤维蛋白溶解能力，40℃保温30min活力无变化，温度超过50℃活力逐渐丧失，超过60℃时，酶活急速下降，但反复冻融对酶活影响不大。当与血清蛋白、胃粘液蛋白以及煮沸过的小麦和大米提取液和肉汤混合后，纳豆激酶的稳定性显著增加，甚至在酸性条件下，酶活只部分消失，说明纳豆激酶在胃环境中能保持一定活性。研究发现，K⁺、Fe²⁺对酶活稳定性无明显影响，而Zn²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Mn²⁺等则表现出不同程度的抑制作用，Hg²⁺可使纳豆激酶完全失活，Mg²⁺和Co²⁺对酶有明显的激活作用。

1.1.2 纳豆激酶的调节血脂作用

纳豆激酶不仅可以溶解血栓，对调血脂和抗动脉硬化也有很重要作用。纳豆脂质中亚油酸占全脂质的50%，有报道亚油酸能降低血浆中的胆固醇含量，有预防动脉硬化、心脏病和高血压的功效，故纳豆激酶具有降低胆固醇的作用。此外，许多动物实验也证实，纳豆菌食品可以有效降低总胆固醇、抑制高血脂症，进而减少粥脉硬化的发生。杨霞等曾用花生油喂食的方法构建高脂血症动物模型，发现在动物模型中添加纳豆激酶组胆固醇明显降低，且这种趋势随着纳豆激酶量的增高更加显著。龚敏等通过研究纳豆激酶对兔血管成形术后再狭窄的影响，推测纳豆激酶可抑制血管成形术后再狭窄，但不是通过影响血小板数目及聚集、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达而发挥作用，而是通过降脂、抗氧化或其他作用直接或间接抑制内膜增生，从而发挥作用。

1.2 本项目的研究意义

利用课题组筛选的纳豆芽孢杆菌，对纳豆激酶发酵生产条件和提取工艺进行优化，利用高血脂实验动物模型评价纳豆激酶的降血脂功效，为其作为降血脂药物和保健品奠定基础。

1.3 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

（1）纳豆激酶菌株的筛选鉴定

分别从北京、大连和日本3个产地的纳豆食品中分离纯化得到了5个具有纳豆芽孢杆菌典型菌落特征的芽孢杆菌单菌落，与模式菌株纳豆芽孢杆菌分别从菌落形态、个体形态和生理生化试验三方面进行对比鉴定。结果表明，5株芽孢杆菌均为纳豆芽孢杆菌。将这5株纳豆芽孢杆菌分别在酪素平板上划线初选，从中筛选出2株活性高的菌株，测定各株发酵液的纳豆激酶酶活力发现具有较高纳豆激酶活性，酶活力分别达到了1428.39和1574.43 IU/mL^-1，明显高于一般菌株。

纳豆芽孢杆菌的筛选与形态鉴定

纳豆芽孢杆菌的分离纯化及纳豆激酶的活性检测

（2）运用筛选的纳豆激酶菌株制作纳豆

以黄豆为原料进行固体发酵制备纳豆食品，检测了纳豆食品的纳豆激酶活力。在初始含水量60%、发酵温度37 ℃的条件下，纳豆激酶发酵活力在20 h达到最大值（93.02 FU/g，以干质量计），达到了商业化纳豆的酶活力水平。

纳豆芽孢杆菌液的培养以及纳豆的制作

1.4 已具备的条件，尚缺少的条件及方法等

盐城师范学院药学院建有生理与药理学、细胞与分子生物学、药物分析、制药工艺学、天然药物化学等专业实验室，总面积达到1800平方米，实验仪器设备总资产达1000多万元。拥有Eppendorf高速冷冻离心机、ZEALWAY全自动数显压力蒸汽灭菌器、Millipore Milli-Q Direct 8纯水仪、冷冻干燥机、超净工作台、电热恒温隔水式培养箱、柜式恒温摇床、722型可见分光光度计、电热鼓风干燥箱等仪器设备，能够满足实验的需要。

课题组已经与盐城琛丹低碳技术研究院有限公司签订合作协议，接受其委托（委托研发经费30万元），共同开发纳豆系列健康产品。

2、项目研究目标及主要内容

2.1 研究目标

首先利用自制的纳豆芽孢杆菌生产纳豆，再经冷冻干燥后的纳豆粉碎成纳豆粉，然后采用疏水柱层析法从纳豆粉中分离纯化纳豆激酶，最后选择Wistar高脂模型大鼠进行降血脂功效研究，为纳豆激酶药物和保健品的产业化开发和应用提供了实验数据。

2.2 研究的主要内容

（1）固体发酵法生产纳豆

将大豆用清水冲洗除杂后，置于3倍量的清水中浸泡18 h；将浸泡好的大豆沥水后，于121 ℃条件下灭菌30 min；待灭菌后的大豆冷却至40 ℃左右时，将纳豆芽孢杆菌接种液态种子，搅拌均匀后放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，将发酵好的纳豆放入4 ℃冰箱后熟24 h，即得成熟的纳豆。

（2）纳豆激酶粗酶液制备

发酵后的新鲜纳豆经送入预冷室冷冻至－35 ℃-40 ℃，转至冻干室，通过温度控制，调节冻干速度冻干，冻干后经粉碎机粉碎即成纳豆激酶粉。称取纳豆激酶粉，用等体积的生理盐水溶解，制备纳豆激酶粗酶液。

（3）纳豆激酶的分离纯化

分级盐析：向纳豆激酶粗酶液中加入硫酸铵至不同饱和度，4 ℃静置12 h后离心，分别检测上清液及沉淀中酶活力。

疏水层析：采用Phenyl Sepharose疏水柱层析分离纯化纳豆激酶。上样缓冲液为NaCl浓度1.5 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.4），阶段洗脱NaCl浓度依次为0.9 mol/L、0.3 mol/L、0，洗脱速度2.0 mL/min，检测并收集吸收峰。

SDS-PAGE电泳：分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，检测纯化的纳豆激酶纯度。

（4）纳豆激酶的降血脂功效

高脂大鼠模型的建立: 大鼠90只，随机分为6组，每级15只，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组( 普伐他汀钠片200 mg/kg) 以及纳豆激酶高剂量组( 360 mg/kg) 、中剂量组( 180 mg/kg) 、低剂量组(90 mg/kg) 。空白组始终喂养基础饲料，其余各组大鼠均换用高脂饲料喂养，2周后眼内眦取血(取血前禁食12h) ，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯（TG）水平。

除空白组外，将喂养高脂饲料2周后大鼠再次根据测定的TC水平进行调整。空白组与模型组每日灌胃蒸馏水1 mL，阳性对照组每日按照剂量给予普伐他汀钠片，实验组按照剂量给予纳豆激酶粉。阳性对照组及纳豆激酶粉高、中、低剂量组分别按照相应的剂量每天灌胃给药1次，连续给药6周，每周称重1次，每次称重前禁食12 h。给药6周后大鼠隔夜禁食12 h，眼内眦取血，测定血清TC、TG 水平。

采用SPSS13.0 统计学软件进行分析，正态计数资料以“x±s”表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3、项目创新特色概述

本研究以课题组筛选所得纳豆枯草芽孢杆菌（产酶量大、活性高，具有较高的生产价值）生产纳豆，制备高纯度纳豆激酶，深入分析纳豆激酶的降血脂功效。创新之处在于：

（1）建立适用于规模化纳豆激酶生产、分离纯化技术体系；

（2）基于高脂动物模型评价纳豆激酶降血脂功效。

4、项目研究技术路线

本项目的研究技术路线如下：

5、研究进度安排

（1）2017年6月至2017年11月

固体发酵法生产纳豆工艺的优化；

纳豆冻干粉制备条件的优化；

纳豆激酶的分离纯化方法的建立。

（2）2017年12月至2018年5月

纳豆激酶降血脂功效评价；

实验数据整理，撰写发表论文；

申报发明专利；

结题报告和材料的准备。

6、项目组成员分工

    徐浩月：项目整体协调，论文、专利的撰写。

    施林燕：纳豆生产工艺的优化。

    许波琳：纳豆激酶冻干粉的制备。

    叶　毅：纳豆激酶的分离纯化。

  钱星舟：降血脂功效分析。

1、该项目在药学院实验室完成，实验场地和仪器设备均能满足学生开展实验和创新训练的需要。

2、组织强有力的导师团队对训练项目进行实时指导，为项目的顺利实施提供条件保障。

1、建立纳豆生产、纳豆激酶制备、纳豆激酶降血脂功效评价技术体系。

2、发表研究论文1篇。

3、申请国家发明专利1项。

一、项目实施情况

1、研究目标

首先利用自制的纳豆芽孢杆菌生产纳豆，再经冷冻干燥后的纳豆粉碎成纳豆粉，然后采用疏水柱层析法从纳豆粉中分离纯化纳豆激酶，最后选择Wistar高脂模型大鼠进行降血脂功效研究，为纳豆激酶药物和保健品的产业化开发和应用提供了实验数据。

本项目按以下技术路线实施：

2、研究过程

（1）固体发酵法生产纳豆

将大豆用清水冲洗除杂后，置于大豆冷却至40 ℃左右时，将纳豆芽孢杆菌接种液态种子，搅拌均匀后放入37 ℃恒3倍量的清水中浸泡18 h；将浸泡好的大豆沥水后，于121 ℃条件下灭菌30 min；待灭菌后的温培养箱中培养24 h，将发酵好的纳豆放入4 ℃冰箱后熟24 h，即得成熟的纳豆。

（2）纳豆激酶粗酶液制备

发酵后的新鲜纳豆经送入预冷室冷冻至－35 ℃-40 ℃，转至冻干室，通过温度控制，调节冻干速度冻干，冻干后经粉碎机粉碎即成纳豆激酶粉。称取纳豆激酶粉，用等体积的生理盐水溶解，制备纳豆激酶粗酶液。

（3）纳豆激酶的分离纯化

分级盐析：向纳豆激酶粗酶液中加入硫酸铵至不同饱和度，4 ℃静置12 h后离心，分别检测上清液及沉淀中酶活力。

疏水层析：采用Phenyl Sepharose疏水柱层析分离纯化纳豆激酶。上样缓冲液为NaCl浓度1.5 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.4），阶段洗脱NaCl浓度依次为0.9 mol/L、0.3 mol/L、0，洗脱速度2.0 mL/min，检测并收集吸收峰。

SDS-PAGE电泳：分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，检测纯化的纳豆激酶纯度。

（4）纳豆激酶的降血脂功效

高脂大鼠模型的建立：大鼠90只，随机分为6组，每级15只，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组（普伐他汀钠片200 mg/kg）以及纳豆激酶高剂量组（360 mg/kg）、中剂量组（180 mg/kg）、低剂量组（90 mg/kg）。空白组始终喂养基础饲料，其余各组大鼠均换用高脂饲料喂养，2周后眼内眦取血（取血前禁食12h），测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平。

除空白组外，将喂养高脂饲料2周后大鼠再次根据测定的TC水平进行调整。空白组与模型组每日灌胃蒸馏水1 mL，阳性对照组每日按照剂量给予普伐他汀钠片，实验组按照剂量给予纳豆激酶粉。阳性对照组及纳豆激酶粉高、中、低剂量组分别按照相应的剂量每天灌胃给药1次，连续给药6周，每周称重1次，每次称重前禁食12 h。给药6周后大鼠隔夜禁食12 h，眼内眦取血，测定血清TC、TG 水平。

采用SPSS13.0 统计学软件进行分析，正态计数资料以“x±s”表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3、研究成果

本研究以课题组筛选所得纳豆枯草芽孢杆菌（产酶量大、活性高，具有较高的生产价值）生产纳豆，制备高纯度纳豆激酶，深入分析纳豆激酶的降血脂功效。主要研究成果如下：

（1）建立适用于规模化纳豆激酶生产、分离纯化技术体系；

（2）基于高脂动物模型评价纳豆激酶降血脂功效。

本项目紧密围绕纳豆激酶的生产和保健功能评价问题，建立一套固体发酵法生产纳豆以及纳豆激酶的分离纯化的有效方法，为纳豆激酶药物和保健品的产业化开发和应用提供了重要的参考价值。创新之处在于：

（1）优化固体发酵法生产纳豆技术；

（2）建立纳豆激酶分离纯化技术体系。

参加项目的目的是为从中得到更多的锻炼，将所学的知识运用到实践中去。我们从中体会到实是求是的科学态度、熟练的实验技能、创新意识和创新能力以及团队协作的重要性，重在实施过程中得到的锻炼和培养。很幸运可以得到这次宝贵的锻炼机会，亲身体会到科学研究的酸甜苦辣。

在实验开始之前，我们查阅读了大量的相关文献，拓宽了知识面。在消化吸收文献的基础上，通过老师的耐心指导，主动认真思考，完成了实验方案设计。在实验操作过程中，不仅学会了相关的实验技术，而且系统掌握了相关仪器设备的使用方法。在论文写作阶段，既学习了统计学软件的使用，了解了科技论文的写作规范，又增强了英文文献翻译能力。此外，我们还不断地向老师请教，与同学交流，无形中增强了我们的学习能力和交流能力。这些不仅是课堂教学的延伸和补充，而且对于激发学习兴趣、了解学科动态、培养探究精神、提高动手能力以及分析与解决问题的能力都有十分重要的意义。 

在综合能力训练方面，提高自我学习能力、团结协作能力和组织实施能力；训练了严谨的科研实践作风、勇于创新的科研态度和不怕困难、刻苦钻研的求知精神；锻炼了勤于理论运用、善于理论分析的能力。在专业技能训练方面，训练文献查阅、分析和实验设计的能力，将所学专业知识应用于具体实践，培养实践与创新能力，提高综合素质。

将研究结果进行理论总结，论文“Molecular cloning and expression analysis of nattokinase gene in Escherichia coli”已在外文期刊发表，为相关研究工作提供了借鉴。

将项目的研究成果整合，参加创新创业大赛并获奖。

经费的支出合理，符合使用规定。

项目的实施达到预期的实践训练目标。